雙熒光素酶報告基因實驗的一些影響因素及注意事項

1．報告基因檢測受多種因素影響（載體狀態、細胞狀態、轉染量、轉染效率、裂解效率、加樣精度、檢測過程等），因此同批次樣品檢測值也可能出現浮動。所以實驗一般需要做3個或3個以上覆孔，並且引入另一個報告基因作為內參。

2．細胞培養時間不宜過長，12-36h內最好；長時間培養後，細胞難裂解。

3．雙熒光素酶報告基因的載體選擇：

a)螢火蟲熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4的載體或自己構建相應的載體；

b)海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4代載體或自己構建相應的載體。建議海腎載體不使用強啟動子（如SV40、CMV），而選用中等強度的啟動子（如TK）。

4．雙熒光素酶報告基因的載體比例：根據實驗具體情況調整。建議作一個預實驗來調整（螢火蟲載體與海腎載體比例分別用1：10、1：20、1：50、1：100），螢火蟲熒光素酶檢測發光值大於海腎熒光素酶發光值的比例較好。

5．最適反應溫度：室溫（20-22℃）。各個組分（細胞裂解產物，底物工作液等）都需要調整到室溫。

6．雙熒光素酶反應體積：20ul（細胞裂解產物）-100ul（螢火蟲熒光素酶底物）-100ul（海腎熒光素酶底物），底物量可根據實際情況調整，但一定要保證底物過量，不然會造成檢測結果出現大的偏差

7．細胞裂解產物存放：常溫不超過6小時；-20℃一個月；-80℃半年

8．裂解產物與底物混合（手動加樣）：要求混合快速、混合時間一致，避免熒光素酶衰變的影響。

9．發光半衰期：

a)單熒光素酶檢測試劑盒（E1500），螢火蟲熒光素酶的`發光半衰期約12min

b)雙熒光素酶檢測試劑盒（E1910），螢火蟲熒光素酶的發光半衰期約9min，海腎熒光素酶的發光半衰期約2min

10．檢測結果

檢測前應檢測孔板或空管的發光值，作為儀器發光背景值，Modulus多功能檢測儀的儀器背景值應小於100；

樣品檢測發光值應該遠大於儀器背景值，例如10000。如果樣品發光值過於接近儀器背景值，說明樣品中熒光素酶過少，需要考慮轉染量、轉染效率、裂解效率等因素。